ELISA樣本測(cè)值低的原因

  ELISA實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常會(huì)遇到樣本測(cè)值低的問題，樣本類型包括血清、 血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液等。假設(shè)實(shí)驗(yàn)操作完全正確，標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，這種情況樣本測(cè)值低可從兩方面進(jìn)行分析：一是樣本本身含量可被檢測(cè)，但由于實(shí)驗(yàn)操作等原因?qū)е聵颖緶y(cè)值不在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi);二是分析物在樣品中本身濃度偏低。下面將從這兩個(gè)方面來進(jìn)行分析導(dǎo)致樣本測(cè)值低的因素以及對(duì)應(yīng)的解決方案。

  1、樣本本身含量可以被檢測(cè)，有哪些原因?qū)е聹y(cè)值低呢?

  (1)試劑盒的保存

  試劑盒要按照規(guī)定的方法保存，實(shí)驗(yàn)者在購(gòu)買試劑盒時(shí)請(qǐng)務(wù)必留心試劑盒不同組分的保存方法。

  (2)樣本上樣前的準(zhǔn)備

  這個(gè)過程包括樣本的制備、保存以及是否有經(jīng)歷過反復(fù)凍融。樣本的制備要根據(jù)樣本類型采用不同的方法，血清、血漿與細(xì)胞裂解液的制備方法均不同。保存，包括保存溫度以及保存時(shí)間。一般推薦樣本制備后進(jìn)行分裝后儲(chǔ)存在-20度或-80度，儲(chǔ)存時(shí)間不宜過久，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存有可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的降解，致使檢測(cè)結(jié)果不理想。后注意不要反復(fù)凍融，蛋白樣本反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致降解發(fā)生。

  (3)稀釋方案

  樣本的稀釋對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要，稀釋過度以及稀釋不足均有可能導(dǎo)致樣本的測(cè)值低。

  稀釋過度：一般情況下客戶都會(huì)根據(jù)文獻(xiàn)測(cè)值，以及檢測(cè)范圍估計(jì)一個(gè)稀釋倍數(shù)，一般的試劑盒在出廠之前也會(huì)做大量檢測(cè)，對(duì)于常規(guī)樣本如血清血漿，會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室樣本測(cè)值情況推薦一個(gè)稀釋倍數(shù)。但實(shí)驗(yàn)者如果直接按照估計(jì)或推測(cè)的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)樣本OD非常低。這是由于文獻(xiàn)作者用的樣本，廠家實(shí)驗(yàn)用的樣本與實(shí)驗(yàn)者的樣本會(huì)存在一定的差異，這些測(cè)值有一定的參考意義，但如果照搬，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以建議實(shí)驗(yàn) 者在正式試驗(yàn)前是先做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的有效性以及佳稀釋倍數(shù)。

  稀釋倍數(shù)不夠：鉤狀效應(yīng)，ELISA實(shí)驗(yàn)中發(fā)生鉤狀效應(yīng)主要是當(dāng)抗原與抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，抗原過量稱為后帶效應(yīng)。當(dāng)樣本中目標(biāo)物含量很高，而沒有進(jìn)行正確的稀釋，就有可能會(huì)導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。解決方案依舊同稀釋過度的解決方案一樣，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

  2、分析物在樣品中本身濃度偏低

  很多時(shí)候，客戶操作沒有問題，標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但檢測(cè)多次樣本依然不在檢測(cè)范圍。像細(xì)胞因子，如 IL-6 需在炎癥刺激情況才會(huì)大量產(chǎn)生，一般非炎癥樣本測(cè)值會(huì)非常低。針對(duì)這種測(cè)值比較低的情況，一般建議根據(jù)文獻(xiàn)選取適合的樣本類型，同時(shí)可以選用高靈敏度的試劑盒。

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