實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)允瓜♂尯蟮臉悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。