免疫熒光(immunofluorescence，IF)，通常是指用熒光標(biāo)記的抗體示蹤或檢查樣品中相應(yīng)抗原的方法。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標(biāo)記在抗體上，與其相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，在熒光顯微鏡下針對(duì)熒光標(biāo)記分子的激發(fā)光發(fā)射光進(jìn)行觀察，從而檢測(cè)目的指標(biāo)的相對(duì)含量、在組織細(xì)胞中的定位。

產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標(biāo)六色)
原理介紹: 酪酰胺信號(hào)放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶          （ HRP） 對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法， 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術(shù)同樣采 用 HRP 標(biāo)記的二抗， 同樣有對(duì)應(yīng)的 “顯色”步驟 （HRP 催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物， 產(chǎn)生  活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價(jià)結(jié)合， 使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光    素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復(fù)合物， 重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。
TSA 詳細(xì)原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價(jià)鍵結(jié)
合位點(diǎn))， 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物， 該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、  組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)    合， 這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積， 結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到 10-100 倍增強(qiáng)。  簡(jiǎn)單  來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP （而不是直接偶聯(lián)熒光素） ， 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。  熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨酸殘基    共價(jià)偶聯(lián)， 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。  然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理，前一輪非共價(jià) 結(jié)合的抗體被洗掉， 共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。  再換個(gè)一抗來第二輪孵育 ， 周而復(fù)始。  等到所有抗體孵育結(jié)束， 熒光素都結(jié)合好后， 最后去檢測(cè)結(jié)果。  由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)， 以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同 種屬抗體選擇匹配的限制。  也就是說， 如果用 TSA 技術(shù)， 同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。  搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。    本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中以下一種或者多種：  480， 520，   570， 620， 690， 780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。  可以實(shí)現(xiàn)單標(biāo)、  雙  標(biāo)、 三標(biāo)以及更多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標(biāo)六色)
試劑盒組成： 520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃；  570 熒光染料 （紅光）  (即用型， 5mL)， -20℃；  620 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃；  690 熒光染料 (即用型， 5mL)， -    20℃；   780 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃；  TSA+增強(qiáng)劑， 100ul，  -20℃ （可選） ；

高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 （15mL） 4℃ （可選）  。
備注：  520 熒光染料 、570 熒光染料、  620 熒光染料、  690 熒 光染料、  780 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

TSA+增強(qiáng)劑使用方法：  TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào) 5-10 倍， TSA+增 強(qiáng)劑：   熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng)， 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標(biāo)六色)
操作流程：
1、 石蠟切片脫蠟至水：  依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風(fēng)廚內(nèi)，酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。
2、 抗原修復(fù)：  組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復(fù)液或者 PH6.0 檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù) 盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù) （也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復(fù)方法）  。 中火 8min， 停火 8min， 轉(zhuǎn)中低火 7min， 此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)， 切勿 干片。  自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復(fù)液 和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定）  。
3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：  切片放入 3%過氧化氫溶液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次， 每次 5min。
4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 （防止抗體流走） ， 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS （或者其他封閉液） 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。
5、 加一抗：  輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X，切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 （濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
6、 加 hrp 二抗：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。
7、 熒光染料反應(yīng)：  XXX 熒光染料反應(yīng) 10-15min， PBS 洗三次。
8、 重復(fù) 2-7 步驟 （換用另外一種 XXX 熒光染料）
9、 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。
10、    封片：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。
11、    鏡檢拍照：  切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。

染料	激發(fā)波長(zhǎng)	發(fā)射波長(zhǎng)
DAPI 藍(lán)色	350	420
480	450	480
520 綠色	490	520